摘 要：为鉴定猕猴桃果实贮藏过程中参与果胶降解的关键酶多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因，以‘徐香’猕猴桃为试材，利用转录组测序（RNA-seq）和实时荧光定量（qRT-PCR）技术，研究了猕猴桃 PG基因在不同成熟进程及外源乙烯诱导后果实中的表达变化。根据 RNA-seq 结果，可以将 37 个 PG 基因在采后不同时期的表达趋势分为 4 类，Achn325011、Achn240441、Achn071601 和 Achn100411，分别在采后 2、4、6 和 8 d 有表达高峰。鉴于果实硬度在常温贮藏 6 d 较 4 d 时急剧下降，因此利用 qRT-PCR 重点验证了其中的 2 类 14 个基因，发现 4 个基因在采后 2 d 和 4 d 明显上调，与果实硬度在 6 d 时的下降相关。进一步利用外源乙烯处理果实，发现其中 1 个基因 Achn071601 在处理与对照果实中的差异表达与同时期果实硬度的变化趋势一致，是猕猴桃关键的 PG 基因。
关键词：猕猴桃；贮藏；转录组测序；PG 基因
▲猕猴桃结果像葡萄一样多了
猕猴桃是典型的呼吸跃变型果实，有明显的生理后熟过程，采后果实质地易软化，影响其商品性（许淼 等，2017）。因此，探讨猕猴桃果实成熟软化机理具有重要意义。研究表明，果实后熟过程中的硬度下降与细胞壁相关酶的活性有关，因此在生产中常用外源药剂处理抑制猕猴桃采后果实中这些酶的活性，从而延长贮藏期（丁建国 等，2003；李佩燕 等，2013；李桦 等，2017）。陈昆松等（2000）研究发现，猕猴桃果实采收时，β–半乳糖苷酶基因表达水平最高，随后呈下降趋势。虽然 β–半乳糖苷酶基因的表达可为外源乙烯所诱导，但在果实乙烯跃变期间却没发现 β–半乳糖苷酶基因显著的表达变化。Zhang 等（2006）利用猕猴桃表达序列标签数据库克隆了脂氧合酶 Lox 基因家族 6 个成员，发现它们在猕猴桃果实成熟过程中具有不同的表达谱，AdLox1 和 AdLox5 对乙烯敏感，表达水平随果实内源乙烯积累趋于增强，与 Lox 酶活性表现一致；同样，这两个基因表达可被外源乙烯所诱导，而其余 4 个成员则对乙烯不敏感。杨绍兰等（2007）克隆了猕猴桃的 α-expansin（EXP）基因，Northern 杂交结果表明 AdEXP1 在采收当天的果实中表达很弱，随着果实成熟衰老进程加快而表达趋于增强。
▲猕猴桃包装盒
多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）是果胶酶的一种，通过催化果胶分子的解聚，促进果实软化（魏潇 等，2011）。目前关于 PG 活性增强与果实成熟软化的关系已经在番茄、苹果（刘静轩 等，2017）、梨、葡萄、桃、柿（宋康华 等，2010）和香蕉等多个树种上得到证实，也在这些树种上分离出了大量 PG 基因（高晓铭 等，2016）。在猕猴桃上，Wang 等（2000）克隆了 3 个 PG基因 CkPGA、CkPGB 和 CkPGC，其中 CkPGA 和 CkPGB 在果实和花瓣上均有表达，而 CkPGC 则仅在成熟果实表达，其表达量可以达到 CkPGA 和 CkPGB 的 50 倍。陈义挺等（2017）以‘米良 1号’猕猴桃果实为材料，研究了室温、低温和脱落酸处理下猕猴桃果实硬度的变化，同时对 AcPG的表达进行了分析，发现 AcPG 参与了猕猴桃果实软化过程。
▲猕猴桃开花授粉
随着高通量测序技术的发展，转录组测序（RNA-Seq）作为一种高效便捷的基因表达分析手段，在不少研究中得到广泛应用。高洁（2013）利用转录组测序对黄肉猕猴桃‘金丰’果实着色过程中相关差异基因的表达进行了解析，发现果实成熟期与转色期之间有 1 457 个差异表达基因，其中 12个调控叶绿素合成及 14 个调控类胡萝卜素合成的基因可能与该黄肉猕猴桃的呈色机理有关。Tang等（2017）对猕猴桃雄性和雌性花进行了转录组测序，共鉴定出 2 503 个差异表达的基因，其中 1 793个基因在雌花中表现为上调，710 个下调。
目前猕猴桃的 PG 基因多数从表达序列标签库或者同源序列克隆获得，可能导致鉴定到的基因并不全面。为了从转录组水平研究 PG 基因与猕猴桃果实硬度变化的关系，以中国猕猴桃主栽品种‘徐香’为试材，在果实成熟后进行常温贮藏，对贮藏后不同时期的果肉进行转录组测序，鉴定其中 PG 基因的表达，并分析 PG 与硬度变化的关系，为发掘猕猴桃中果实质地性状形成相关的 PG 基因，解析猕猴桃果实成熟软化的分子机制奠定研究基础。
▲猕猴桃苗
1 材料与方法
1.1 试验材料及其贮藏期间果实硬度测定
2016 年 9 月，自猕猴桃主产区河南省西峡县一商品果园采摘 6 年生‘徐香’猕猴桃（Acinidiachinensis）大小一致、无病虫害的成熟果实，迅速运至实验室，常温贮藏（25 ℃、湿度约 60%）。
贮藏 2、4、6 和 8 d，分别取 6 ~ 8 个果实，去皮，采用 FT327 型果实硬度计（Fruit TestTM，意大利）测定果实去皮硬度，随后取混合果肉至液氮冷冻后–80 ℃保存，供提取 RNA。
1.2 外源乙烯处理试验
2017 年 10 月，采摘猕猴桃果实，以乙烯利（购自中国农业科学院郑州果树研究所果树生长发育调控中心）为外源乙烯处理的试剂（浓度为 500 mg · kg-1），浸果 3 min，取出晾干，室温保存。在处理后 1 ~ 7 d，每天采用 TA-XT plus 型质构仪（Stable Micro Systems，英国）测定果实去皮硬度，探头直径 5 mm，测定速度 2.0 mm · s-1，下降位移 5.0 mm。另取样冷冻保存备用提取 RNA。
1.3 RNA 提取及反转录
利用多糖多酚植物 RNA 提取试剂盒（华越洋公司，北京）提取果肉 RNA，加 DNaseⅠ（TaKaRa公司，大连）去除 DNA，利用琼脂糖电泳和 NanoDrop 2000（Thermo，Waltham，MA，USA）检测RNA 的纯度，利用 Ist Strand cDNA Synthesis Kit（TAKARA 公司，大连）进行反转录合成单链 cDNA。
1.4 RNA-seq
利用单链 cDNA、dNTPs、RNase H 和 DNA polymeraseⅠ合成双链 cDNA，添加接头，纯化并构建测序文库，在 HiSeq 2500（Illumina，San Diego，CA，USA）上进行测序，试剂全部来自 Illumina公司。测序结果去除接头和低质量序列后，利用 TopHat 2（Kim et al.，2013）软件将序列比对至参考基因组（Huang et al.，2013），基因表达量采用 FPKM（Fragments per kb per million reads）值表示。
1.5 荧光定量 PCR 验证
根据果实硬度的变化，选择 14 个在采后处理中期有明显上调的基因采用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）法进行 RNA-seq 结果的验证，目的基因和内参 Actin 基因特异引物见表 1。qRT-PCR 反应试剂盒购自 TaKaRa 生物技术公司，按照说明书添加适量的 cDNA 模板、引物和荧光染料，在 ABI7900HT 实时定量 PCR 仪（ABI，Carlsbad，CA，USA）上进行反应。程序为 95 ℃3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 20 s，40 个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。参考 Livak & Schmittgen（2001）的方法，根据原始 Ct 值计算目的基因的相对表达量。
▲zespri yellow kiwi
2 结果与分析
2.1 PG 基因在染色体上的分布
猕猴桃有 29 条染色体，根据基因组功能注释结果（Huang et al.，2013），PG 基因共 37 个，分布在 17 条染色体（图 1），其中第 17 号染色体有 4 个，第 6、7、12、18 和 20 号染色体各有 3 个，其他染色体上分布的较少。PG 基因在单个染色体上的分布也没有明显规律，在第 6、7、11、13、15、17、18 和 20 号染色体上存在 2 个基因成对排列的现象，其余基因则彼此之间距离较远。
2.2 常温贮藏过程中果实硬度的变化
如图 2 所示，常温贮藏 2 d 和 4 d，果实硬度差异不大，4 d 时为 13.56 kg · cm-2。随着贮藏时间的延长，果实硬度明显下降，贮藏 6 d时果实硬度为 2.01 kg · cm-2，仅为贮藏初期的14.8%；贮藏 8 d 与 6 d 时相比变化不明显。
▲红心猕猴桃套果袋
2.3 常温贮藏过程中 PG 基因的表达变化在果实贮藏过程中，转录组测序共检测出25 109 个表达的基因。其中贮藏 2 d 时表达基因最多，达到 22 939 个；4 d 和 8 d 表达基因分别有 22 156 和 22 165 个；而 6 d 时（果实硬度显著下降）表达基因最少，仅有 21 670。根据 PG基因的全基因组注释，37 个 PG 基因中，仅有 28个基因检测到有表达的转录本，这 28 个基因在不同贮藏期的相对表达量变化如图 3 所示。根据 28 个 PG 基因在贮藏后不同时期的表达趋势，将它们分成 4 类（图 3），即 1、2、3、4类基因分别在贮藏 6、8、2 和 4 d 有明显表达。由于猕猴桃果实硬度在贮藏 2 和 4 d 差异不大，6和 8 d 之间差异也不明显，仅在 6 d 有明显下降。鉴于基因表达变化可能出现在表型变化之前，所以推测第 1 类（贮藏 6 d 明显表达）和第 4 类（贮藏 4 d 明显表达）基因可能与果实的硬度下降相关。
为验证 RNA-seq 得到的基因表达结果，选择第 1 类中的 6 个基因（Achn080501、Achn208711、Achn071601 、 Achn228271 、 Achn032311 和Achn144331）和第 4 类的 8 个基因（Achn032321、Achn240441 、 Achn114381 、 Achn184431 、Achn057911 、 Achn236671 、 Achn118371 和Achn100771）进行了 qRT-PCR 分析（图 4）。
从 图 4 可以看出， 3 个 第 1 类基因（Achn208711、Achn228271 和 Achn032311）和4 个第 4 类基因（Achn032321、Achn057911、Achn236671 和 Achn118371），利用 RNA-seq 得到的基因 FPKM 值均小于 1，表明该类基因表达量非常低，暗示其可能不是导致果实硬度降低的关键基因。另外的 3 个第 1 类基因（Achn080501、Achn071601 和 Achn144331）和 4 个第 4 类基因（ Achn240441 、Achn114381 、 Achn184431 和Achn100771），利用 RNA-seq 所得到的基因 FPKM 值均大于 1，与利用 qRT-PCR 得到的基因相对表达量的相关性分别为–0.193、0.996、0.931、–0.309、0.431、0.999 和 0.747，即除了 Achn080501和Achn240441之外，其余基因的表达结果在两种方法间是比较一致的。其中，第4类基因Achn184431利用 qRT-PCR 和 RNA-seq 得到的相对表达量在贮藏第 4 天分别是第 2 天的 1.75 倍和 2.00 倍，而第4类基因Achn240441利用qRT-PCR和RNA-seq得到相对表达量在贮藏后第4天分别为第2天的0.94倍和 2.58 倍；2 个第 1 类基因 Achn071601 和 Achn144331 在 6 d 也较 4 d 明显上调，利用 qRT-PCR得到的相对表达量分别达到 8.41 倍和 7.81 倍；该结果暗示这 4 个基因可能是导致‘徐香’猕猴桃果实硬度下降的关键基因。
▲sungold g3 阳光金果
2.4 外源乙烯对 PG 基因表达的诱导作用
PG 基因的表达通常受到乙烯的诱导（陈昆松 等，2000；Zhang et al.，2006）。对照果实在贮藏 1 d 和 5 d 时硬度快速下降，其他时期相对稳定；而外源乙烯处理的果实硬度持续下降（图 5）。
外源乙烯处理后的果实，上述 4 个表达差异较大的基因的表达变化如图 6 所示。对照果实的 Achn184431 基因在贮藏 4 d 时有 1 个明显的高峰，而外源乙烯处理的 Achn184431则随着贮藏期的延长呈下降趋势。在整个贮藏期，Achn184431 的表达量虽然在对照与处理间的个别时期差异不明显，但总体趋势显示对照均高于乙烯处理，表明其不受外源乙烯的诱导。
▲红心猕猴桃果园
对照的 Achn240441 基因在处理后 4 d 时有 1 个强度不明显的表达高峰，而乙烯处理的Achn240441 的表达量峰值出现在 2 d 时。比较对照与处理果实中该基因的表达，显示在贮藏 2 ~ 6 d内，对照高于处理，说明其与同时期处理的果实硬度下降无关。对照的 Achn144331 基因在贮藏 4 d 时出现表达高峰，而乙烯处理的果实贮藏 2、4 和 6 d 均低于对照，最高值出现在贮藏 7 d 时。由于外源乙烯处理与对照果实硬度变化最明显的差异出现在乙烯处理后 4 d，因此，该基因在贮藏 7 d 的高表达可能与外源乙烯诱导无关。
Achn071601 基因在对照果实贮藏 6 d 时出现表达高峰，而在处理果实中随着贮藏时间的延长呈上升趋势，在 7 d 时表达最高。比较其在对照和处理果实中的表达，发现从采后 2 d 开始，Achn071601在处理果实的表达均高于对照，与同期果实硬度在处理和对照果实间的差异一致，暗示其可能是导致果实硬度下降的原因。
▲猕猴桃苗
3 讨论
在猕猴桃基因组测序和注释完成之前，对关键基因的克隆多使用图位克隆或者同源克隆的方法。图位克隆依赖遗传图谱的构建和精细定位，进展缓慢；而同源克隆则可能只克隆到某个基因家族中的部分成员，遗漏全基因组的信息。如 Wang 等（2000）在猕猴桃中克隆的 3 个基因 CkPGA、CkPGB 和 CkPGC，分别对应猕猴桃基因组 Achn124031、Achn080501 和 Achn051381 基因。在本研究中，Achn124031 在‘徐香’猕猴桃果实中不表达，Achn080501 虽然有表达，但表达量较低，且qRT-PCR 显示其在整个果实贮藏过程中变化不明显；Achn051381 在果实贮藏 6 d 有表达，且随着贮藏时间的延长持续上调，趋势与 Wang 等（2000）的结果类似。然而 Achn051381 基因在贮藏 8 d 的FPKM 值仅为 1.33，表达量远小于同时期本研究新鉴定的 2 个关键基因，如 Achn071601（59.18）和 Achn144331（10.25）。陈义挺等（2017）根据猕猴桃转录组数据库克隆到 1 个 PG 基因 AcPG，该基因在猕猴桃‘米良 1 号’果实室温贮藏 7 d 后表达水平急剧下降至贮藏前的 1/5。本研究中发现AcPG 基因对应 Achn118371，虽然 qRT-PCR 表明其在‘徐香’猕猴桃果实贮藏 6 d 后同样较贮藏 2 d同样有明显下调，但表达量较低，可能并不是导致‘徐香’猕猴桃果实硬度下降的关键基因。
猕猴桃基因组测序于 2013 年完成（Huang et al.，2013），为全面系统地研究基因家族的所有成员提供了重要的基础。在本研究中，基于基因组注释结果可以看出，PG 基因共有 37 个，远多于前人研究中所涉及的 PG 基因数量。利用 RNA-seq 结合 qRT-PCR 技术，本研究初步筛选出 4 个表达量较高且在果实常温贮藏条件下硬度变化关键期发生明显上调的 PG 基因；进一步通过外源乙烯处理猕猴桃果实，发现其中 Achn071601 的诱导表达与果实硬度的变化密切相关。
综上所述，本研究利用 RNA-seq 技术从转录组层面鉴定出 4 个与果实硬度变化相关的 PG 基因，通过外源乙烯处理则推测 Achn071601 可能是‘徐香’猕猴桃中调控果实贮藏期果实硬度变化的重要候选基因。
Abstract：RNA-sequence and real-time quantitative polymerase chain reaction（PCR）technique （qRT-PCR）were used to identify the expression of key polygalacturonase（PG）genes involved in pectin degradation in kiwifruit，stored at room temperature at different time periods during storage. The expression pattern of 37 PG genes could be divided into 4 groups according to the RNA-sequence results of different samples stored at room temperature. For example，Achn325011，Achn240441，Achn071601 and Achn100411 genes present a peak expression at 2，4，6 and 8 days after harvest. Fourteen PG genes belonging to groups 1 and 4 were verified using the qRT-PCR as a decrease in fruit firmness on the 6 d after storage was observed. Among these PG genes，the expression of 4 genes was related to the fruit firmness change. Moreover，the expression of these 4 genes was also evaluated in kiwifruits treated with exogenous ethylene. The results of ethylene treatment showed that the expression of a single gene called Achn071601 was consistent with the fruit firmness change during the storage period. Therefore，Achn071601 should be considered as a key PG gene in kiwifruit.
Keywords：kiwifruit；storage；RNA-seq；PG gene
