摘 要：系统调查了中国陕西省猕猴桃主产区周至、眉县、杨凌和汉中‘徐香’、‘海沃德’、‘华优’和‘秦美’猕猴桃上猕猴桃病毒 A（AcVA）和猕猴桃病毒 B（AcVB）的带毒率和分布情况。结果表明，AcVA 和 AcVB 在 4 个产区均有广泛地分布和较高的带毒率。其中，AcVA 和 AcVB 分别在杨凌（36.7%）和眉县（36.9%）有最高的带毒率。按照品种划分，AcVA（32.3%）和 AcVB（32.9%）均在‘徐香’品种上有最高的带毒率。通过高通量测序与分析获得了 AcVA 和 AcVB 的基因组序列，其分别由 7 654 和7 454 个核苷酸组成，与之前报道的TP7-93A 和 TP7-93B 分离物对应的同源率分别为82.7%和 78.5%。AcVA和 AcVB 外壳蛋白基因系统发育树显示，2 种病毒分成 2 个组，存在较大的分子变异。
中国的猕猴桃种植面积和产量均位居世界第一（Belrose，2016）。陕西省是中国最大的猕猴桃生产省份，截止 2017 年，陕西省的猕猴桃种植面积已超过 6.7 万 hm2，产量超过 130 万 t。陕西省的猕猴桃种植区域主要集中在周至、眉县、武功、杨凌、汉中等地，种植品种主要有‘徐香’、‘海沃德’、‘秦美’、‘华优’、‘翠香’、‘红阳’、‘秦紫 1 号’和‘秦紫光 1 号’等（吴永朋 等，2019；张莹 等，2020）。
▲猕猴桃苗
近年来，全世界不断有猕猴桃病毒病害的报道，在这些报道的病毒中，一部分是猕猴桃上发现的新病毒，另一部分是已知的以猕猴桃为新寄主的病毒（Blouin et al.，2013；Chavan et al.，2013；Zheng et al.，2017）。目前为止，已报道可侵染猕猴桃的病毒主要有猕猴桃病毒 A（Actinidia virus A，AcVA）、猕猴桃病毒 B（Actinidia virus B，AcVB）、猕猴桃病毒 1（Actinidia virus 1，AcV-1）、猕猴桃褪绿环斑相关病毒（Actinidia chlorotic ringspot-associated virus，AcCRaV）和黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）等（Pearson et al.，2011；Blouin et al.，2012，2013；Wang et al.，2016；彭期定 等，2020）。
前期调查研究发现陕西省 AcVA、AcVB、AcCRaV 和 CMV 等病毒是侵染‘徐香’猕猴桃的主要病毒（Zhao et al.，2019）。其中 AcVA 和 AcVB 是 2012 年首次在新西兰猕猴桃上发现的病毒（Blouin et al.，2012）。目前关于这两种病毒的基因组，分别只有来自新西兰的一条全基因组的报道（Blouin et al.，2012）。这两种病毒在中国陕西省猕猴桃主产区海沃德、华优和秦美猕猴桃品种上的带毒率、分子变异一直未有相关的研究报道。
本研究中系统调查了陕西周至、眉县、杨凌和汉中的徐香、海沃德、华优和秦美猕猴桃上 AcVA和 AcVB 的带毒率，测定了这 4 个主产区 2 种病毒的多个全长外壳蛋白基因序列，分别分析了它们的分子变异情况；这两个病毒中国分离物的基因组也一直未有相关的研究报道，本研究中通过高通量测序和分析，分别获得了 AcVA 和 AcVB 中国陕西周至分离物的基因组序列。
▲红心猕猴桃果园
1 材料与方法
1.1 材料
分别于 2018 年和 2019 年的 4—5 月，在陕西周至、眉县、杨凌和汉中随机采集表现疑似病毒病症状的‘徐香’、‘海沃德’、‘华优’和‘秦美’猕猴桃叶片。共采集了 126 个猕猴桃园的 458 份样品，每个果园采集 3 ~ 5 份样品。所有样品保存于–80 ℃备用。
1.2 病毒的 RT-PCR 检测
参照 TRIzol 试剂盒说明书的方法提取猕猴桃叶片样品的总 RNA。用微量紫外分光光度计测定RNA 浓度后，取 1 µg 总 RNA 用随机引物和 M-MLV 反转录酶合成 cDNA（Zhao et al.，2012）。分别用 Blouin 等（2012）和 Zheng 等（2017）报道的引物序列检测 AcVA 和 AcVB。扩增 AcVA 和AcVB 全长外壳蛋白基因的引物根据已报道的 AcVA 和 AcVB 的全基因组设计。引物序列为AcVACPF：TGCCTAGCGTGTATGAAGC；AcVACPR：CCGTGAGAAATGATGGGTC；AcVBCPF：CTTCCCTGGTTACTTTGTG；AcVBCPR：GTTTATTCACGCCTGTCTC。所有引物均用如下 PCR程序：94 ℃变性 3 min，94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 次循环。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测和测序确定有无目标病毒。
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1.3 克隆、序列测定与分析
PCR 产物经 DNA 回收试剂盒纯化后，连接到 pMD19-T 载体，转化 JM109 大肠杆菌。PCR 检测阳性克隆送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，每个样品送 3 个克隆。用 CLUSTAL X（Thompson et al.，1997）软件对本研究中所测定的以及 GenBank 中已有的 AcVA 和 AcVB 的全长外壳蛋白基因序列进行比对。然后用MEGAv.7.0软件，使用NJ法构建系统发育树（Tamura et al.，2011）。
1.4 转录组测序与分析
取 1 个采集自陕西周至，经 RT-PCR 检测确定同时被 AcVA 和 AcVB 侵染的海沃德猕猴桃样品，送武汉华大基因科技有限公司进行 RNA 的提取，去 rRNA 建库，用 Illumina HiSeq X-ten 平台进行测序。测序完成后用 CLC Genomics Workbench 9.5 软件进行分析，去除接头和低质量的序列后与GenBank 中已报道的猕猴桃的基因组进行匹配分析。用 Trinity program（Haas et al.，2013）软件对没有匹配的序列进行组装，获得大片段。在 NCBI 数据库对所获得的大片段进行 BLAST，分别找到与 AcVA 和 AcVB 同源的序列。
▲猕猴桃采收
2 结果与分析
2.1 AcVA 和 AcVB 的带毒率
在许多表现褪绿和畸形的叶片样品中可检测到 AcVA 和 AcVB（图 1）。AcVA 和 AcVB 在陕西周至、眉县、杨凌和汉中等不同主产区的猕猴桃样品中带毒率不同（表 1），它们分别在杨凌（36.7%）和眉县（36.9%）的带毒率最高。AcVA 和 AcVB 带毒率最低的主产区均为汉中，分别为 16.9%和15.5%。AcVA 和 AcVB 在陕西不同猕猴桃栽培品种上的带毒率不同（表 2），均在徐香品种上有最高的带毒率，分别为 32.3%和 32.9%。AcVA和 AcVB 带毒率最低的品种分别为‘秦美’（23.6%）和‘华优’（23.7%）。
2.2 转录组分析结果
猕猴桃样品经过转录组测序，获得了 67 048 288 条序列。经过去除接头和低质量序列后与猕猴桃基因组进行匹配，获得了 2 876 725 条（4.29%）未匹配的序列。经过组装，获得了 7 133 条片段。片段的长度为 200 ~ 18 860 nt。经过 BlastN 和 BlastX，获得了 2 条序列分别与 AcVA 和 AcVB 匹配，为 AcVA 和 AcVB 陕西周至分离物的基因组序列。同时还获得了多条序列分别与 AcCRaV 和 CMV匹配。证明该样品中含有 AcVA、AcVB、AcCRaV 和 CMV。
▲红心猕猴桃图片
2.3 AcVA 和 AcVB 的基因组分析
本研究所获得的 AcVA 和 AcVB 的分离物分别命名为 AcVA-ZZ 和 AcVB-ZZ，其基因组序列长度分别为 7 654 和 7 454 nt（GenBank 登录号分别为 MN022295 和 MN022296）。AcVA 和 AcVB 的基因组结构与已报道的 AcVA 和 AcVB 基因组结构相同，含 5 个开放阅读框（ORF）。其中 ORF1编码多聚蛋白，行使复制酶蛋白的功能。ORF2 编码功能未知的假定蛋白，ORF3 编码运动蛋白，ORF4 编码外壳蛋白，ORF5 编码 RNA 结合蛋白。本研究中获得的 AcVA-ZZ 分离物与新西兰报道的 TP7-93A 的全基因组同源率为 82.7%，5 个 ORF 的核苷酸和氨基酸序列同源率分别为 80.1% ~ 92.1%和 81.4% ~ 99.1%。本研究中获得的 AcVB-ZZ 分离物的基因组与新西兰报道的 TP7-93B 之间同源率为 78.5%，5 个 ORF 之间的核苷酸同源率为 69.2% ~ 89.9%，对应的 5 个蛋白的同源率为72.2% ~ 97.6%。本研究中获得的 AcVA-ZZ 和 AcVB-ZZ 分离物的 5 个 ORF 之间，均是 ORF2 变异最大，ORF1 和 ORF3 次之，ORF4 和 ORF5 则变异较小。
▲redkiwifruit猕猴桃▲
2.4 AcVA 和 AcVB 的分子变异
测定了来自周至（徐香、海沃德、华优）、眉县（徐香、海沃德、秦美）、杨凌（徐香、华优、秦美）和汉中（海沃德、华优、秦美）的 12 个 AcVA 外壳蛋白基因序列（GenBank 登录号：MH457010 ~ MH457021），和来自周至（徐香、海沃德、华优）、眉县（徐香、海沃德、华优）、杨凌（徐香、海沃德）和汉中（华优、秦美）的 10 个 AcVB 外壳蛋白基因序列（GenBank 登录号：MH457022 ~ MH457031）。如图 2 所示，利用本研究中获得的 12 个与之前在徐香猕猴桃上测定的 28 个和新西兰报道的 2 个 AcVA 的外壳蛋白基因序列构建系统进化树，42 条 AcVA 的外壳蛋白基因序列分为 2组，其中第 1 组又分为 2 个亚组。本研究中大多数分离物的序列聚集在第 2 组，少数聚集在第 1 组。如图 3 所示，利用本研究获得的 10 个与之前在徐香猕猴桃上测定的 16 个和新西兰报道的 2 个AcVB 的外壳蛋白基因序列构建系统进化树，28 个 AcVB 的外壳蛋白基因序列分为 2 组，其中第 1组又分为 2 个亚组。本研究中大多数分离物的序列聚集在第 1 组，少数聚集在第 2 组。
▲sungold g3 kiwifruit vine
3 讨论
AcVA 和 AcVB 都是乙型线形病毒科葡萄病毒属的成员。葡萄病毒属目前已发现的病毒成员包括 AcVA 和 AcVB 在内已有 14 个（Blouin et al.，2012）。该属成员被报道的侵染对象主要是葡萄，而 AcVA 和 AcVB 是 Blouin 等（2012）首次在新西兰猕猴桃上发现的。据报道，AcVA 和 AcVB 同时侵染中华猕猴桃时，症状表现为斑驳、褪绿和环斑等症状，当只有 AcVB 侵染中华猕猴桃时症状表现为系统轻斑驳（Blouin et al.，2012）。本研究中在陕西省调查发现无论是被 AcVA 和 AcVB 同时侵染，还是被其中 1 个单独侵染的植株，症状均表现为叶片皱缩和褪绿的症状。仅从症状表现上难以区分该样品是被单一病毒侵染还是被多个病毒混合侵染。
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之前在陕西省徐香猕猴桃上调查了 AcVA 和 AcVB 的带毒率，分别为 40.5%和 35.5%（Zhao et al.，2019）。本研究中发现，AcVA 和 AcVB 在陕西周至、眉县、杨凌和汉中不同产区的猕猴桃样品中带毒率不同，其中 AcVA 和 AcVB 分别在杨凌（36.7%）和眉县（36.9%）的带毒率最高。同时，AcVA和 AcVB 在陕西不同猕猴桃栽培品种上的带毒率不同，均在徐香品种上最高，分别为 32.3%和 32.9%。在猕猴桃生产中，种植户常常关注猕猴桃溃疡病的危害，而忽略了猕猴桃病毒的存在，在嫁接过程中造成了猕猴桃病毒的大量传播，致使猕猴桃病毒在陕西省有较高的带毒率。在今后猕猴桃生产过程中，猕猴桃病毒病应引起种植者的重视。尤其在猕猴桃栽培时，应选用无毒苗，在嫁接时要确保砧木和接穗均无病毒。
由于 AcVA 和 AcVB 都只有一条全基因组的报道，无法用全基因组构建系统发育树分析全基因组的之前变异情况。本研究克隆并测定了多个 AcVA 和 AcVB 的外壳蛋白基因序列，分析了其分子变异情况，发现基于外壳蛋白基因的进化树，AcVA 和 AcVB 均分为明显的 2 个组，表明 AcVA 和AcVB 在陕西存在明显的分子变异。
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AcVA 和 AcVB 均是葡萄病毒属的成员，关于葡萄病毒属成员的传播介体，前人曾有过关于蚜虫、蚧壳虫、粉蚧壳虫传播葡萄病毒属病毒的报道（Adams et al.，2012）。而在猕猴桃上可能传播病毒的介体种类较少，目前还没有传播猕猴桃病毒介体的报道。因此，AcVA 和 AcVB 在田间可能主要通过嫁接传播。
本研究结果表明，AcVA 和 AcVB 均在陕西省有广泛的分布和较高的侵染率。从地区分布来看，AcVA 和 AcVB 分别在杨凌（36.7%）和眉县（36.9%）的带毒率最高。按照品种划分，AcVA（32.3%）和 AcVB（32.9%）均在徐香品种上的带毒率最高。本研究中还通过高通量测序与分析，分别获得了AcVA 和 AcVB 中国分离物的基因组序列，它们与之前报道的 TP7-93A 和 TP7-93B 分离物对应的同源率分别为 82.7%和 78.5%。AcVA 和 AcVB 外壳蛋白基因系统发育树显示，2 种病毒均分成明显的2 个组，存在较大的分子变异。本研究结果将为 AcVA 和 AcVB 遗传进化和防治的研究提供基础数据。关于 AcVA 和 AcVB 的生物学特性和致病性，还需要进一步的深入研究。
▲猕猴桃采收
Abstract：Kiwifruit（Actinidia spp.）viruses has seriously damaged kiwifruit production. This study investigated the incidence and distribution of Actinidia virus A（AcVA）and Actinidia virus B（AcVB）in four major kiwifruit cultivars （‘Xuxiang’，‘Hayward’，‘Huayou’and‘Qinmei’）grown in Shaanxi. The results showed that AcVA and AcVB were widely spread，with high infection rates in Shaanxi. Among the four main kiwifruit producing areas tested in this study，the highest infection rates for AcVA and AcVB were obtained in Yangling（36.7%）and Meixian（36.9%）. Among the four tested kiwifruit cultivars，the highest infection rates for AcVA（32.3%）and AcVB（32.9%）were obtained in‘Xuxiang’. This study conducted next-generation sequencing and obtained the genome sequence of AcVA-ZZ and AcVB-ZZ isolates which consisted of 7 654 and 7 454 nucleotides，respectively. The genomes of AcVA-ZZ and AcVB-ZZ isolates were 82.7% and 78.5% homologous with those of TP7-93A and TP7-93B isolates previously reported. Phylogenetic trees of AcVA and AcVB coat protein gene showed substantial sequence variations and therefore were considered as two distinct clades.
Keywords：Actinidia；Actinidia virus A；Actinidia virus B；genome；molecular variability；virus
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▲redkiwifruit猕猴桃
